A replicação do DNA é semi-conservativa, cada uma das fitas serve como molde para a construção de uma nova molécula. Esse processo permite que a informação genética (seqüência de nucleotídeos) seja copiada de modo extremamente simples e eficiente.
Em condições normais a dupla hélice de DNA é muito estável, por exemplo, apenas em temperaturas muito altas (próximas a 1000 C) as pontes de hidrogênio são desfeitas e as fitas complementares se separam. Porém, a transferência de informação genética, seja através de replicação (transferência de informação de uma molécula de DNA para outra) ou de transcrição (transferência de informação de uma molécula de DNA para uma molécula de RNA) depende da separação das fitas complementares. É necessário que a dupla hélice seja desfeita, que as bases sejam expostas para formação da nova fita complementar. As cadeias de DNA separadas (em fita simples) constituem as fitas moldes para o processo de replicação.
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
A replicação ou duplicação do DNA é um processo complexo, realizado por um conjunto de proteínas que recebe o nome de maquinaria ou máquina de replicação.
A replicação do DNA só ocorre porque “proteínas iniciadoras” sintetizadas no momento adequado (fim de G1) se ligam a sítios específicos do DNA, denominados de origens de replicação. A ligação das proteínas iniciadoras nas origens de replicação promove a separação das duas fitas do DNA, expondo um pequeno número de bases sem pareamento
.
As origens de replicação são formadas por seqüências de nucleotídeos especiais – em leveduras, por exemplo, são conjuntos de aproximadamente 100 pares de bases (pb), ricos em bases AT (mais fáceis de serem separadas). O número de origens de replicação é variável, dependendo da espécie ou do grupo de organismos.
O genoma das bactérias tem uma organização bem simples, sendo constituído por uma única molécula de DNA circular maior (o cromossomo bacteriano) e pequenos círculos de DNA (os plasmídeos), cada um desses elementos contém apenas uma origem de replicação.
Para os cromossomos eucariontes, formados por longas moléculas de DNA linear, existem várias origens de replicação, o que permite que a duplicação do DNA se inicie simultaneamente em vários locais dos cromossomos, tornando o processo mais rápido. Estima-se que o genoma humano, formado por um conjunto de 23 moléculas de DNA (células n), tenha aproximadamente 10.000 origens de replicação.
FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO
A partir de cada origem de replicação formam-se duas forquilhas que permitem a replicação bidirecional.
As proteínas que participam da replicação afastam progressivamente as fitas de DNA, a partir do espaço criado na origem de replicação. Assim, a extensão de fita molde vai se ampliando e permitindo a entrada de nucleotídeos complementares que se orientam espontaneamente no sentido anti-paralelo ao da fita molde (Figura 21). A velocidade de deslocamento das forquilhas é grande, no DNA humano estima-se que seja de 100 pb/segundo e em bactérias é dez vezes mais rápido.
DESLOCAMENTO DA DNA POLIMERASE
Para que a replicação ocorra, a DNA polimerase deve se associar á fita molde do DNA e se deslocar sobre ela, realizando as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos livres que parearam com as bases da fita molde.
A DNA polimerase sempre faz a ligação de um novo nucleotídeo a partir da extremidade 3’- OH livre do último nucleotídeo, por isso, costuma-se dizer que a fita nova do DNA “cresce” da extremidade 5’ para a extremidade 3’ e que a DNA polimerase se “desloca” na fita nova de 5’para 3’.
Cada uma das fitas da dupla hélice tem sua polaridade definida pelo modo como as pentoses estão posicionadas - enquanto uma fita tem orientação 5’-3’a outra têm orientação 3’-5’. A mesma orientação anti-paralela é mantida na fita nova que se forma durante a replicação do DNA. Assim, apenas uma das fitas novas terá a extremidade 3’-OH livre voltada para a direção em que a forquilha de replicação se move. Como a DNA polimerase só pode adicionar novos nucleotídeos em uma extremidade 3’-OH livre, uma das fitas novas crescerá acompanhando a forquilha de replicação e a outra será produzida em direção oposta ao do deslocamento da forquilha.
A fita nova com a extremidade 3’-OH livre voltada para a direção oposta ao deslocamento da forquilha de replicação terá crescimento descontínuo, será produzida aos poucos, em pequenos pedaços denominados fragmentos de Okazaki.
Nessa fita, a DNA polimerase se ligará á fita molde e se deslocará em sentido oposto ao da abertura da forquilha, sendo necessário que periodicamente abandone a fita molde, retorne á forquilha de replicação e novamente se ligue à fita molde, sintetizando um novo trecho de DNA. A velocidade de replicação da fita com extremidade 3’-OH livre voltada “para fora” da forquilha é menor e por isso ela TAMBÉM é denominada de fita retardatária. A outra fita, que tem extremidade 3’-OH livre voltada “para dentro” da forquilha, é denominada de fita líder.
ATIVIDADE REVISORA DA DNA POLIMERASE
Os pareamentos entre as bases A-T e C-G são ditos obrigatórios, embora esses sejam apenas os pareamentos mais estáveis que se pode obter entre purinas e pirimidinas. Eventualmente, outros tipos de pareamentos podem se formar, por exemplo, pares G-T, G-A ou U-G. Esses pares são bem menos estáveis, mas que se não fossem detectados como “erros” de pareamento causariam grandes alterações na informação genética transmitida de uma célula para outra.
A DNA polimerase tem atividade revisora, ou seja, é capaz de verificar se os nucleotídeos da fita nova estão corretamente pareados com a fita molde. A atividade revisora (ou mecanismo de revisão, verificação ou proofreading) permite que antes de realizar adição de um novo nucleotídeo, a DNA polimerase verifique se o último nucleotídeo que foi ligado á fita de DNA nascente está corretamente pareado com a fita molde.
Se o pareamento estiver incorreto, a DNA polimerase desfaz a ligação fosfodiéster e o nucleotídeo mal pareado é desligado da cadeia de DNA em formação. A capacidade de remover nucleotídeos da extremidade da fita de DNA nascente corresponde à atividade de nuclease da DNA polimerase. Essa enzima, portanto é capaz de realizar duas atividades bem diferentes: realiza polimerização de nucleotídeos no sentido 5’-3’ e degrada a fita de DNA (remove nucleotídeos) no sentido 3’-5’ .
SEGMENTOS INICIDADORES DA DNA POLIMERASE
A atividade de revisão que a DNA polimerase executa antes da adição de um novo nucleotídeo é obrigatória. Se não existir ligação para revisar, a DNA polimerase também não pode fazer polimerização. É necessário que exista sempre alguns nucleotídeos já ligados entre si e pareados com a fita molde, para que e DNA polimerase possa atuar. Esse pequeno trecho de fita nova, pareada com a fita molde, fornece a extremidade 3’-OH livre, para que a DNA polimerase possa adicionar o próximo nucleotídeo.
A DNA polimerase não faz síntese de novo, porque necessita de um pequeno fragmento que forneça a extremidade 3’-OH livre para iniciar sua atividade. Isso significa dizer que a DNA polimerase não pode iniciar a construção da nova fita de DNA, ligando entre si os dois primeiros nucleotídeos.
O pequeno segmento de fita nova que permite a ação da DNA polimerase recebe o nome de primer ou seqüência iniciadora. Essa seqüência de nucleotídeos fornece os pareamentos necessários para a atividade de revisão da DNA polimerase e a extremidade 3’-OH livre para a polimerização.
Como nenhuma DNA polimerase faz síntese de novo, a enzima que faz a ligação entre os primeiros nucleotídeos que iniciam a síntese de uma nova fita de DNA (primer) pertence à outra classe. Essa enzima, denominada de primase, é classificada como RNA polimerase pois utiliza como substrato ribonucleotídeos. Na verdade, cada nova fita de DNA é iniciada por um pequeno trecho de RNA, aproximadamente 10 ribonucleotídeos ligados entre si e complementares á fita molde de DNA.
Para a fita líder (fita nova que “cresce” acompanhando o deslocamento da forquilha de replicação) é necessário apenas um primer na origem de replicação. A DNA polimerase se liga á extremidade 3’-OH livre dessa seqüência de ribonucleotídeos e passa a fazer as ligações entre os desoxirribonucleotídeos complementares a fita molde, acompanhando a abertura da forquilha de replicação.
Na fita retardatária ou descontínua, é necessário que, periodicamente, a primase adicione um novo primer. A partir de cada primer é construído um fragmento de fita nova de DNA, mas como o deslocamento da DNA polimerase é no sentido contrário ao da abertura da forquilha de replicação, logo a enzima não encontra mais fita molde disponível e abandona o DNA. Para produzir uma fita nova complementar a fita molde que foi recém exposta pelo deslocamento da forquilha, é preciso ocorrer a adição de um novo primer. Os fragmentos de DNA que compõem a fita de DNA com replicação descontínua são chamados de Fragmentos de OKazaki.
A fita com replicação descontínua é transformada em uma fita de DNA completa, sem interrupções e sem ribonucleotídeos através da atividade de outras três enzimas. A remoção do primer é feita por uma nuclease (enzima que destrói ácidos nucléicos, removendo nucleotídeos) e uma D
NA polimerase especial, denominada de polimerase de reparo, faz a ligação entre os dessoxirribonucleotídeos complementares á região antes ocupada pelo primer. Finalmente, a DNA-ligase faz a união entre a extremidade 5’de um fragmento e a e extremidade 3’do outro, eliminando as interrupções que existiam na fita retardatária.
A primase, como toda RNA polimerase, não possui atividade revisora e os primers podem conter vários erros de pareamento, isso porém não constitui fonte de mutações uma vez que todos os primers são removidos e substituídos. As ligações entre os novos nucleotídeos que substiuem o primer são feitas pela DNA polimerases que atuam no reparo de DNA e que possuem atividade revisora.
OUTRAS PROTEÍNAS DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
A abertura da dupla hélice depende da atividade de enzimas denominadas DNA-helicases, que catalisam o desenrolamento do DNA (Figura 30).
A deficiência de atividade de DNA-Helicase durante muito tempo foi associada a um distúrbio raro, conhecido como Síndrome de Hutchinson-Gilford (Figura 31). O envelhecimento precoce é sem dúvida a característica mais notável dessa síndrome. A hipótese era que o mal funcionamento da helicase seria responável por renovação deficiente dos tecidos. Em 2002, finalmente foi identificado o gene relacionado a esse distúrbio e não é um gene para helicase. A hipósete original não foi confirmada. A proteína associada e esse tipo de progeria pertence à família das lamininas e se localiza na membrana nuclear.
As fitas simples que são produzidas pela passagem da helicase rapidamente tornariam a se associar se não fosse a presença de proteínas que se ligam á fita simples. São essas proteínas, denominadas de SSB (single-strand DNA-binding proteins), que evitam a formação de pontes de hidrogênio entre as bases das fitas molde (Figura 32).
Também participa da replicação uma proteína, denominada de grampo deslizante que forma um anel em torno da fita molde e faz com que a DNA polimerase fique firmemente associada ao DNA molde (Figura 33). Na fita com replicação descontínua, o grampo deslizante libera a DNa polimerase, cada vez que chega em um fragmento já pronto.
A frente da forquilha de replicação de deslocam as girases, enzimas classificadas como topoisomerases, que reconhecem as regiões em que a dupla hélice do DNA está apresentando “maior torção”. É necessário lembrar que a ação da helicase, ao abrir a dupla hélice de DNA, faz com que as “voltas” removidas da região aberta sejam transferidas “para frente”.
(Situação semelhante pode ser observada quando tentamos separar um fio de lã afastando os fios menores. Se o fio tiver apenas alguns centímetros e possuir extremidades livres, a separação fará com que as extremidades girem. Se o fio for muito longo, a abertura provocara a formação de dobramentos nas regiões á frente da abertura).
Carlos Fontes
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